癌症疫苗技术自诞生起便成为全球研究者关注的焦点，它通过刺激人体的免疫系统来预防或治疗癌症。想要通过癌症疫苗治疗肿瘤，首先需要找到合适的肿瘤抗原。肿瘤新抗原是肿瘤组织特有的突变肽段，由于在正常组织不表达，非常适合用于癌症疫苗的开发。然而，不同肿瘤、不同患者的新抗原差异非常大，因此该方法适合开发成针对单个患者的个性化癌症疫苗，实现肿瘤的个体化精准治疗。肿瘤组织微环境具有缺氧和免疫抑制等特点，因此一些细菌可以在肿瘤定植和增殖。例如大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)，一种益生菌，无致病性和毒副作用，可以高效定植在肿瘤组织，因此有潜力被开发成药物递送的载体。本文研究团队对EcN进行了工程化改造，使其能够搭载新抗原并精准递送到肿瘤组织，通过招募和激活免疫细胞杀伤肿瘤。
结果
改造益生菌，构建癌症疫苗
为了构建癌症疫苗，研究团队首先对EcN进行了改造，使其能够表达筛选出的新抗原肽段阵列，并能精准定植到肿瘤组织，从而激活免疫系统发挥抗癌作用（图1）。主要的改造包括：（1）优化新抗原的合成形式；（2）去除隐秘质粒，删除Lon和OmpT蛋白酶以增加新抗原的累积；（3）提高对吞噬作用的敏感性，以便抗原呈递细胞摄取，并呈递MHC II结合新抗原肽段；（4）使EcN表达李斯特菌溶血素 O（LLO），便于其进入细胞质，从而通过MHC I呈递表达的新抗原肽段，并诱导辅助性 T 细胞 1 型（TH1）免疫；（5）降低EcN在血液中的存活时间和生物膜形成能力，提升治疗的安全性。
图1 改造益生菌肿瘤新抗原疫苗
益生菌癌症疫苗的体内抗肿瘤作用
接下来，研究团队首先构建了小鼠皮下移植CT26结直肠癌肿瘤模型，评价了这种益生菌癌症疫苗的体内抗肿瘤作用（图2）。改造后的大肠杆菌（EcNcΔlon/ΔompT/LLO+）携带19个新抗原肽段（nAg19），可以抑制肿瘤的生长，甚至部分小鼠达到了完全缓解（CR）的水平（图2 a c）。LLO的表达显著提升了肿瘤中活性形式的白细胞介素12（IL-12 p70）水平，表明其能提升体内辅助性T细胞1型（TH1）的诱导作用（图2 b）。改造后的益生菌在尾静脉注射后，可以精准定植到肿瘤组织（图2 d），且表现出良好的安全性。与典型的合成长肽（SLP）癌症疫苗策略比较，对已发生的肿瘤，nAg19表现出良好的抗肿瘤作用，而nAg19-SLP无明显效果（图2 e）。进一步在肿瘤转移模型中（CT26-Luc），益生菌癌症疫苗能够显著抑制肿瘤的转移，并且所有小鼠的生存期都达到了45天以上（图2 f-h）。这些结果表明，无论是对侵袭性还是转移性肿瘤模型，益生菌癌症疫苗都表现出良好的有效性和安全性。
图2 益生菌癌症疫苗对侵袭性和转移性结直肠癌的疗效
益生菌肿瘤新抗原疫苗的抗肿瘤机制
由于这种改造的益生菌肿瘤新抗原疫苗是强效的免疫刺激剂，并且可长期存在于肿瘤微环境（TME），研究团队推测它可能通过持续产生新抗原，减轻免疫抑制作用，增强适应性免疫的激活，从而治疗肿瘤。为了证实新抗原在肿瘤中的递送情况，他们在新抗原末端加上His标签（EcNcΔlon/ΔompT/LLO+ nAg19-His），在治疗后的肿瘤和肿瘤引流淋巴结（TDLN）中成功鉴定到这些新抗原（图3 a）。此外治疗后TDLN中CD80+和CD86+的1型和2型树突状细胞 （cDC1s cDC2s）占比增加，表明这种癌症疫苗可以募集并激活树突状细胞（图3 b c）。在治疗后8天，对分离出的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）使用新抗原肽段刺激，发现分泌干扰素 γ 的Foxp3−CD4+和CD8+ TILs占比增多，表明益生菌肿瘤新抗原疫苗可以增强新抗原特异的免疫功能（图3 d）。将上述TILs与肿瘤细胞共培养，发现它们也可以发挥新抗原特异的体外抗肿瘤作用（图3 e）。除此之外，益生菌肿瘤新抗原疫苗还引起了肿瘤驻留的免疫抑制性PD-L1+Ly6G+多形核细胞和PD-L1+F4/80+巨噬细胞减少（图3 f）。另外两种抑制抗肿瘤免疫功能的细胞，Foxp3+CD4+调节性T细胞和MHC-IIloF4/80+肿瘤相关巨噬细胞，在治疗后含量也降低（图3 g）。综上所述，这种癌症疫苗可以在肿瘤淋巴组织中不断表达新抗原，招募并激活树突状细胞，减轻TME的免疫抑制作用，实现对肿瘤的免疫治疗（图3 h）。
图3益生菌肿瘤新抗原疫苗可重构肿瘤免疫微环境
益生菌肿瘤新抗原疫苗治疗黑色素瘤
由于不同肿瘤的新抗原有很大区别，研究团队进一步测试了他们构建的平台能否适用于其他肿瘤的治疗。在用B16F10细胞构建的黑色素瘤小鼠模型中，这种益生菌肿瘤新抗原疫苗表现出的各种特性与在结直肠癌模型中相似。这些结果表明，在不同遗传背景和不同肿瘤模型中，这种益生菌肿瘤新抗原疫苗均可发挥免疫调节和抗肿瘤作用。
关键点
1. 本研究构建了一种基于益生菌的新抗原递送平台，可以同时把大量结合不同MHC的新抗原定向输送到肿瘤组织，发挥免疫调节和抗肿瘤作用。
2. Rapid Novor（快序生物）基于质谱从头测序技术的Immunovor肿瘤新抗原鉴定利器，可以一网打尽来自基因组、转录组、蛋白组层面所有突变的MHC I/MHCⅡ结合肽段，加速癌症疫苗的开发。
参考文献
Redenti A, Im J, Redenti B, Li F, Rouanne M, Sheng Z, Sun W, Gurbatri CR, Huang S, Komaranchath M, Jang Y, Hahn J, Ballister ER, Vincent RL, Vardoshivilli A, Danino T, Arpaia N. Probiotic neoantigen delivery vectors for precision cancer immunotherapy. Nature. 2024 Oct 16. doi: 10.1038/s41586-024-08033-4.
