CAR-T细胞疗法在白血病中取得了不错的疗效，但是进一步将CAR-T运用于实体瘤治疗时其效果却不尽人意。这是因为CAR-T靶向的是细胞表面的抗原，而大多数致癌因子是来源于细胞内的蛋白，来源于细胞内的致癌因子无法被CAR-T识别和攻击。TCR-T靶向细胞内突变的蛋白能够显著的杀伤肿瘤细胞。如果CAR-T细胞也能靶向细胞内的致癌蛋白，那么将成为克服实体瘤的有力工具。
神经母细胞瘤是一种几乎没有突变的肿瘤，是由表观遗传失调所导致的。想要靶向这类非突变肿瘤是十分困难的，本文采取的以肽段为中心的CAR-T技术（PC-CARs）解决了这一难题。
摘要
团队在神经母细胞瘤的免疫肽组中发现了肿瘤发生所必需的肽段QYNPIRTTF，该肽段是由HLA-A*24:02呈递到细胞表面的非突变肽，来源于神经母细胞瘤的主要转录调控因子PHOX2B。为了靶向QYNPIRTTF，团队开发了以肽段为中心的嵌合抗原受体（PC-CARs）。同时该PC-CARs还可以识别由HLA-A*23:01呈递的QYNPIRTTF。最后，团队在体内实验中证明了PC-CARs能高效和特异性杀伤神经母细胞瘤细胞，小鼠的肿瘤达到了完全消退的程度。这些数据表明，PC-CARs能够扩大免疫治疗的靶点范围，尤其是无免疫原性的细胞内癌蛋白，并可以靶向多种HLA基因型。
图1. 肿瘤特异性抗原发现和CAR-T改造全流程
结果
肿瘤特异性抗原的鉴定
首先，团队通过MHC捕获、肽段洗脱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），对8个高危的神经母细胞瘤原发肿瘤进行免疫肽组学检测，重点检测HLA-A*02:01和HLA-A*24:02结合的肽段。质谱鉴定到9117个肽段，使用IC50阈值小于500nM筛选出6483个强结合肽段。结合TARGET和GTEx数据库筛选出肿瘤组织和正常组织差异表达的133个肽段。去除在正常组织中表达的肽段，还剩56个肽段（图2b）。最后根据pMHC复合物结合亲和力、HLA等位基因频率、亲本基因差异表达程度、MHC与其他肽的相对丰度、多发性神经母细胞瘤肿瘤的复发以及与神经母细胞瘤生物学的相关性对肽段进行了排序。从CHRNA3、GFRA2、HMX1、IGFBPL1、PHOX2B和TH中各选择一个肽段进行临床前开发（图2d）。
图2.肿瘤特异性抗原的发现和筛选
通过检测PHOX2B的表达量发现，PHOX2B在所有正常组织中均不表达，只在神经母细胞瘤中高表达（图3e）。然后团队利用时间转录组学研究了发育过程中PHOX2B的动态表达。结果发现，PHOX2B只在胎儿发育期间表达，在出生后就不表达了（图3h）。由此表明PHOX2B在神经母细胞瘤中是一种高度特异性的肿瘤抗原，是肿瘤靶向治疗的理想候选物。
图3. PHOX2B在肿瘤中特异性高表达
2. 筛选靶向PHOX2B的scFv
由于PHOX2B的非突变肽QYNPIRTTF缺乏免疫原性，经过多次筛选，均没有发现高亲和力的T细胞受体（TCRs）。团队于是放弃TCR-T方法，选择使用CAR-T的筛选方法，找到靶向pMHC复合物的抗体单链可变区片段（scFv）。
为了筛选特异性的scFv，团队采用了保留展示（Retained Display）系统，该系统是一种蛋白质展示平台，可以在通透的细菌内，使用流式细胞技术筛选pMHC结合的scFv。文库的复杂度>1011，通过流式细胞术筛选到25个scFv。利用sCRAP预测了交叉反应性最低、特异性最强的克隆10LH进行进一步开发，与其他候选的scFv相比，只有两个肽段与10LH的相对结合度>10%（图4b）。
图4.筛选pMHC特异性的scFv
3. PC-CAR T细胞可以识别不同HLA基因型上的相同多肽
团队使用抗原呈递工具ShinyNAP8来预测能够呈递相同QYNPIRTTF肽段的其他HLA基因型。该工具确定了其他8个常见的HLA。接着使用四聚体染色实验测量了10LH识别这些pMHC复合物的能力。除了HLA-A*24:02外，10LH还可以结合HLA-A*23:01呈递的QYNPIRTTF。总之，这些发现证明PC-CAR具有扩大接受免疫疗法患者群体的潜力。
4. PC-CAR T细胞选择性地消除肿瘤
团队使用转导10LH和302LH的CAR-T细胞治疗患有神经母细胞瘤的小鼠。用10LH转导的PC-CAR T细胞治疗小鼠，在HLA-A*24:02（SKNAS和COG-564x）和HLA-A*23:01肿瘤模型（NBSD）中都有显著的杀伤肿瘤效果（图5g）。其中COG-564x模型是由一名多次复发的高风险MYCN扩增神经母细胞瘤患者死后抽血生成的。在这个小鼠模型中，肿瘤的生长速度非常快。在本次实验中，在PC-CAR T细胞治疗后仅1周，肿瘤就有显著的衰减。
图5.PC-CAR T细胞在不同肿瘤模型中的杀伤效果
讨论
作者根据免疫肽组筛选到一个神经母细胞瘤的特异性靶点-非突变肽QYNPIRTTF，但是非突变肽没有免疫原性，不能引发T细胞反应，这是因为T细胞一般不会识别自身抗原，因此不适用于TCR-T治疗（文中没有筛选到识别该非突变肽的高亲和力T细胞受体），这样导致了有好的靶点，却没有好的工具去靶向它。“山重水复疑无路，柳暗花明又一村”，作者并没有放弃，而是找到一条新的出路。利用筛选抗体的方法，找到一个特异性的scfv靶向非突变肽，并通过基因工程将scfv表达在CAR-T上，让CAR-T细胞能靶向无免疫原性的肽段，进而能杀伤实体瘤细胞。由此开辟了全新的道路，使得CAR-T能靶向实体瘤的同时，也能靶向无免疫原性的靶点。
关注点
文中使用的免疫肽组检测方法是基于蛋白组学搜库的方法，这种方法基本上检测不到突变的肽段。如果使用快序生物的从头测序技术，一种不依赖于数据库的肽段鉴定方法，能够发现更多的突变肽段，提供更广泛的靶点。我们使用高分辨率、高精度的质谱仪结合快序独立研发的蛋白从头测序分析平台，可以准确鉴定到样品中的突变氨基酸，从而突破了肿瘤样品突变负荷的限制。即使在那些突变负荷很低的肿瘤中，我们的肿瘤新抗原鉴定服务也能比普通蛋白组学搜库方法鉴定到更多突变肽段。
2. 文中使用的基于文库筛选scFv的方法，但是文库的容量毕竟是有限的，因此所能得到的scFv的多样性也大打折扣。而通过免疫动物得到的抗体，亲和力和特异性更强。快序生物的抗体发现技术能够从各种动物甚至是人的血液样品中发现天然的抗体，帮助您直接而高效地发现更多功能性天然抗体。
参考文献：
Yarmarkovich M, Marshall QF, Warrington JM, et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature. 2023;623(7988):820-827.
