生物类似药,也称生物仿制药,是指在质量、安全性和有效性方面与已获准注册的原研药具有相似性的治疗用生物制品。生物类似药是用活细胞产生的生物大分子,要做到百分百复制原研药是具有挑战性的。要想生物类似药与原研药(参照药)几乎没有差异,则需要对两者的结构和功能进行全面和细致的分析比较,尽量减少因细微结构差异造成的影响,以及预测两者临床疗效的相似性。本文就是通过多种方法联合分析了生物类似药和原研药的结构和功能差异。
Omalizumab(奥马珠单抗)是一种重组的人源化单克隆抗体,为抗IgE单克隆抗体,是全球首个批准治疗中度到重度哮喘的靶向治疗药物。IgE是一类只发现于哺乳动物内的抗体,是正常人血清中含量最小的免疫球蛋白。IgE由黏膜下淋巴组织中的效应B细胞产生,可引起过敏反应,同时可能与机体抗寄生虫免疫有关。当寄生虫和过敏原入侵时,血清中的IgE的含量有明显的提升。
摘要:
研究团队联合多种分析方法表征了原研药omalizumab和其生物类似药结构和功能的特征,选取的研究对象是三种抗人源IgE的单克隆抗体:诺华公司的原研药奥马珠单抗omalizumab(OMAref),在HEK293细胞中表达的相同序列版本(OMAver),以及在HEK293细胞中表达的三个氨基酸替换的变体(OMAvar)。氨基酸序列经REmAbTM单克隆抗体测序证实,OMAver与OMAref 的同源性为100%。使用表面等离子体共振法(SPR)测定了抗体的结合亲和力和动力学,OMAver与OMAref结合IgE的能力只有轻微的差异。在体内和体外的实验中验证了抗体的免疫抑制功能,OMAver与OMAref都显示出相似的剂量依赖效果,而变体OMAvar的活性较差。本文的研究不但评估了omalizumab生物类似药的结构和功能特征,还可以帮助抗IgE新药改善其治疗活性。
结果
REmAbTM对单克隆抗体进行从头测序
首先,作者使用了快序生物(Rapid Novor)全球领先的蛋白从头测序技术REmAbTM来检测原研药omalizumab的完整序列。然后,根据omalizumab(OMAref)的序列信息(OMAref是在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达的),在HEK293细胞中生产了OMAver和OMAvar单克隆抗体。接着再用REmAbTM技术来验证三种抗体的序列差异。序列分析显示,OMAref与OMAver氨基酸序列100%相同,且都具有原研药Xolair®(omalizumab)专利保护的序列。此外,OMAref和OMAver都在重链恒定区的301位天冬酰胺(Asn301)上有一个N-糖基化位点,且均未发现O-糖基化位点。与预想的一致,OMAvar的可变区有三个氨基酸的替换。
SPR表征单克隆抗体与人源IgE的结合动力学
表面等离子共振技术(SPR)是利用光学系统检测生物传感芯片上抗原与抗体之间的结合和解离全过程,可以用来表征抗体结合抗原的亲和力情况。这三种抗体的本质是抗人源IgE的抗体,人源IgE在此处视作一种抗原。
团队分析了所有批次(5个购买的OMAref,3个OMAver,1个OMAvar)的单抗与人源IgE的结合动力学,OMAref的结合速率常数Ka为0.93~1.06,解离速率常数Kd为0.84~1.18,两个常数的相对标准偏差(RSD)分别为10%和13%。OMAver的Ka和Kd的RSD均为17%,表明其批次间变异性略高于OMAref。单个OMAvar的Ka值为0.63,明显低于OMAref和OMAver。
三种单克隆抗体的体内活性比较
团队使用小鼠被动皮肤过敏试验(PCA)模型评估了三种单抗的体内活性。PCA小鼠模型是一种肥大细胞依赖模型,可用于评估体内抗IgE抗体的活性。团队同时评估了5个剂量的OMAref、OMAver和OMAvar的体内活性(图3)。OMAref表现出剂量依赖效应,在最低剂量为0.3:1(0.3µg OMAref / 1µg IgE)时,OMAref对局部炎症的抑制率为17%。在最高剂量下(30:1),OMAref的抑制作用达到80%。OMAver表现出类似的效果,与OMAref相比,五种浓度的抑制作用没有统计学上的显著差异。在最低和最高剂量下,OMAver抑制作用分别为20%和97%。但OMAvar与OMAref/OMAver相比,其5个剂量的抑制作用较弱,最大抑制效果仅为41%。
关键点
OMAver和OMAref的对比显示,即使具有相同氨基酸序列的单克隆抗体也会有轻微的功能差异,提示了表达纯化载体的选择对抗体的功能有一定的影响。
而OMAvar与OMAref/OMAver只有三个氨基酸的不同,却表现出结合力和功能上双重差异。这些差异可能是由于不同表达系统翻译后修饰的不同,以及抗体蛋白三维结构上的变化。因此获得完全准确的单克隆抗体的氨基酸序列对于生物类似药的开发和随后的功能验证至关重要。
我们快序生物拥有全球领先的单克隆抗体测序技术REmAbTM。针对抗体蛋白进行从头测序(de novo sequencing),无需细胞系、无需DNA,应用高精度、高分辨率的质谱设备,仅需极少的样品(100ug),就能以100%准确度和100%覆盖率确定任何物种、任何亚型的抗体序列数据。
参考文献:
Urbano A, Plaza J, Picado C, de Mora F. Combined analytical assays for the characterization of drugs binding to human IgE: Applicability to omalizumab-bearing biosimilar candidates assessment. Biomed Pharmacother. 2023;169:115848.