摘要：
单克隆抗体（单抗）是生命科学和医学研究中必不可少的试剂和工具，其传统生产的方法依赖于杂交瘤细胞。研究人员希望获得有良好可重复性的单抗，但杂交瘤细胞并不稳定也很脆弱，使得通过这种方法生产的单抗存在质量不可控的风险。例如可能会发生突变、产生额外的抗体链，甚至因杂交瘤细胞死亡导致抗体永久丢失。此外，当前市场上商业化抗体的标准验证体系尚不完善，这常常使研究人员陷入研究结果的可重复性危机，使科学研究的可信度和效率面临挑战。
重组抗体表达技术是解决抗体在生产、储存、及应用过程中所遇问题的有效策略。而使用该技术的最重要先决条件便是要了解原始抗体的完整氨基酸序列，这通常可以通过杂交瘤测序和蛋白从头测序实现。杂交瘤细胞测序直接解析杂交瘤细胞系中的抗体基因序列，因此依赖于杂交瘤细胞。而蛋白从头测序则独辟蹊径，直接对抗体蛋白进行测序，获得准确序列，不需要任何的基因信息。因此在杂交瘤细胞丢失或死亡时，蛋白从头测序技术是复现抗体的最好方法。
本文中的研究团队设计并阐述了获得重组单克隆抗体和抗体片段的详细策略。他们首先使用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术和杂交瘤测序技术，获得了一系列靶向细胞有丝分裂过程中动粒相关复合物的抗体序列。然后，对这些序列进行重组表达，并对抗体进行工程化改造。他们不仅实现了抗体的种属转换，还制备出多样化的抗体片段（scFvC、scFv、Fab），并成功将抗体片段逆向构建为全长抗体。结果表明，所有获得的重组抗体和抗体片段均显示出与有丝分裂细胞中动粒的强结合能力，展示了通过这种策略获得重组抗体的有效性和灵活性。
重组抗体凭借其卓越的可重复性和可操作性等优势，在生物与医药研究领域中得到广泛应用。本研究展示了一种利用先进的蛋白从头测序技术，快速获得重组表达抗体的方法。同时这种方法具有出色的普适性，可以灵活应用于任何抗体的改造研究中，为抗体研究领域注入新活力。
图1 利用REmAb蛋白从头测序技术获得抗体序列用于工程化改造和重组表达
结果
制备靶向有丝分裂相关靶点的重组单抗
本文中，研究团队通过对有丝分裂中的一系列关键蛋白的特异性抗体进行测序、改造、重组表达，充分展示该抗体生产流程的有效性、灵活性以及普适性。首先，研究团队对已经报道的Hec1抗体“9G3”，通过Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得了抗体的精确全长序列（图2 A-B），并进行重组表达（图2 C-D）。在HeLa细胞上的免疫荧光实验证实，测序后重组表达的rMAb-Hec1ms在有丝分裂的各个时期均可识别动粒（图2 E），且该作用是Hec1特异的（图2 F-G）。通过该技术流程，研究团队同时测序并重组表达验证了KNL1的磷酸化抗体（pMELT）、CENP-C抗体。研究团队还通过对杂交瘤细胞测序，获得并重组表达验证了BubR1、Mad2抗体。
图2 重组表达Hec1单克隆抗体
改造抗体的种属
在间接免疫荧光实验中，为有效检测和放大信号，需要使用荧光标记的二抗来识别一抗。然而商业化的一抗种属通常有限，制约了标记二抗的选择和该方法的应用。因此研究团队接下来便基于测序和重组表达技术，对抗体的种属进行改造。他们将先前获得的 rMAb-Hec1ms的恒定区转换为兔IgG的恒定区（图3 A），获得了rMAb-Hec1rb。改造后的抗体保留了对动粒的识别能力，且被兔二抗识别，不再被鼠二抗识别（图3 B）。此外，研究团队还用类似的策略，对上述测序获得的抗体序列进行了人源化改造（图3 C-F），进一步拓宽了这些抗体的应用范围和潜力。
图3 通过重组表达技术改造抗体的种属
获得重组抗体片段
对于某些细胞生物学、生物医学的应用场景，抗体片段相较于完整抗体展现出更优的应用潜力。研究团队接下来便展示了如何从已获取的抗体序列出发，获得scFvC、scFv和Fab抗体片段（图4 A）。进一步通过多种实验手段验证了它们结合靶标的活性和特异性：包括免疫荧光（scFvC，图4 B-E）、GFP标签融合表达（scFv，图4 F）、荧光染料标记（Fab，图4 G-H）。
图4 基于全长抗体获得抗体片段
对抗体片段反向工程化获得全长抗体
在间接免疫荧光试验中，全长抗体的恒定区起到重要作用，它能够被二抗识别，实现信号的放大和灵敏度的提升。因此研究团队展示了如何从识别HA标记的scFv抗体片段出发，获得全长的抗体（rMAb-HArb，图5 A）。为了在细胞中测试抗体并验证其特异性，研究团队在Hela细胞中分别表达了HA标记的Hec1（图5 B）、HA和GFP标记的Hec1（图5 C）、GFP标记的Hec1（图5 D）。结果表明rMAb-HArb可以识别表达Hec1-HA和Hec1-HA-GFP，而非Hec1-GFP的细胞。通过类似的方法，研究团队将α tubulin的scFvC抗体片段转化成了全长抗体，并通过实验证实了其不仅保留了原有的抗原特异性，还能够被兔二抗特异性识别（图5 E-F）。
图5 从抗体片段出发获得全长抗体
关键点
对抗体进行蛋白从头测序后重组表达，可以解决传统的杂交瘤抗体制备中面临的诸多挑战和限制。
本文研究团队开发了一种通用的生成重组单克隆抗体和抗体片段的方法，可应用于任何抗体的改造研究中。
利用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得的重组单克隆抗体显示出了对靶标蛋白的强结合能力。
参考资料
1. DeLuca KF, Mick JE, Ide AH, Lima WC, Sherman L, Schaller KL, Anderson SM, Zhao N, Stasevich TJ, Varma D, Nilsson J, DeLuca JG. Generation and diversification of recombinant monoclonal antibodies. Elife. 2021 Dec 31;10:e72093
2. https://www.rapidnovor.com/generation-and-diversification-of-recombinant-monoclonal-antibodies
