引言
抗体（Abs）作为生命科学和医学研究中不可缺少的工具，其可靠性对于确保研究结果的可重复性至关重要。然而，通过动物生产的单克隆抗体（mAb）和多克隆抗体（pAb）往往存在批次间差异大的问题，严重影响抗体的质量和性能的稳定性。使用抗体测序和重组表达技术是克服可重复性挑战的有效策略，助力mAb和pAb的稳定化和可靠化生产。
杂交瘤的不稳定性导致单克隆抗体可重复性差
杂交瘤技术是生产单克隆抗体（mAb）最经典且广泛应用的方法之一，该技术流程涉及使用抗原免疫的动物，从脾脏中分离出分泌抗体的B细胞，随后将其与骨髓瘤融合，以获得可稳定且持续生产抗原特异性mAb的永生化杂交瘤细胞系。然而使用杂交瘤生产抗体在实际应用中仍面临多重挑战，导致其在免疫分析和体外诊断（IVD）中应用的可重复性和可靠性不高。
具体而言，当出现支原体或其他类型的细胞污染时，杂交瘤细胞系生产的mAb质量会显著下降。此外杂交瘤细胞可能存在的遗传漂变和额外链也会影响mAb的结合特性。根据一项评估185个杂交瘤细胞系的研究显示，其中超过30%的杂交瘤抗体存在额外轻链或重链，并且该现象会显著降低抗体的特异性和亲和力 [1]。此外，杂交瘤细胞存在死亡或意外丢失的风险，这给抗体在免疫分析和IVD领域的持续可靠应用带来了不确定性。
多克隆抗体的批次间差异
多克隆抗体（pAbs）凭借其多表位结合的特性，在某些应用领域中展现出了显著优势。然而pAbs是通过用抗原刺激动物，引发免疫反应和亲和力成熟过程，随后进行血浆分离、亲和富集纯化获得的复杂混合物。由于不同批次间免疫动物诱导的免疫反应存在差异，生产的pAbs通常存在较大的批次间差异。
更为棘手的是，一旦用于生产抗体的动物死亡，该pAbs就无法继续生产。而重新开发新的pAbs又需要大量的研发工作和时间、成本的投入。基于这些原因，有研究者提出了pAbs应逐渐退出研究的观点[2]。解决这一困境的一种有潜力的策略是对pAbs进行测序，对获得的单抗序列进行重组表达和组合，复现原始多抗的性能，并实现稳定可控的生产。
抗体测序和重组表达确保抗体试剂的可重复性
使用蛋白从头测序技术来精确解析mAbs和pAbs的氨基酸序列，并对获得的序列进行重组表达，是获得可重复性抗体的一种可靠策略（图1）。
图1 使用从头抗体测序和重组表达技术，实现单克隆抗体（mAbs）和多克隆抗体（pAbs）的可重复生产。
单抗测序
蛋白从头测序技术是一种基于质谱的蛋白序列分析手段，通过该技术仅使用少量的蛋白样品，便可对mAbs的全长进行精准测序。快序生物的REmAb单抗从头测序技术可以获得包括CDRs的100%准确的完整抗体序列，并且完全不依赖于任何细胞系或基因信息。使用REmAb技术对mAbs进行测序，研究人员不仅可以重新获得因杂交瘤细胞系丢失、死亡、突变等原因无法继续生产的抗体，还可以对抗体进行重组表达，使抗体的生产摆脱对杂交瘤细胞系的依赖。
多抗测序
从头测序技术同样适用于复杂的pAbs混合物，可以从中发现能够重现原始pAbs结合特性的mAbs全长序列。快序生物的REpAb多抗测序技术可以对直接免疫动物血清多抗进行测序，并且无任何种属限制。通过该技术获得的抗体序列可以组合成重组表达单抗的混合物，以重现原始多抗的性能和稳定生产。
重组表达
重组抗体（rAbs）技术使用基因工程和表达系统，可以稳定生产高质量的抗体。该技术首先使用蛋白从头测序技术获得mAbs和pAbs的抗体序列。随后将抗体轻链和重链基因分别插入两个质粒，然后共转染到表达系统（如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系）中，利用宿主细胞生产所需的抗体。接下来，可以使用Protein A/G和/或亲和纯化的方法对抗体进行纯化，并进行表征以评估抗体性能。哺乳动物细胞（如CHO细胞或HEK293细胞）因有卓越的蛋白质折叠能力和翻译后修饰（如糖基化）能力，成为大多数rAbs重组表达的首选宿主细胞。通过这一系列流程可以生产高质量的，与天然免疫系统中抗体相似的rAbs，为科学研究、疾病诊断和治疗等领域提供强有力的支持。
结语
综上所述，使用蛋白从头测序技术和重组表达技术，我们可以有效应对抗体的可重复性危机。快序生物（Raipd novor）作为蛋白从头测序技术的全球领跑者，其创新的REmAb单抗和REpAb多抗测序技术可以高效且准确地从单抗和血清多抗中测得抗体序列，助力抗体行业快速发展。
参考资料
1. Bradbury ARM, et al. When monoclonal antibodies are not monospecific: Hybridomas frequently express additional functional variable regions. MAbs. 2018 May/Jun;10(4):539-546. doi: 10.1080/19420862.2018.1445456.
2. Bradbury A, Plückthun A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 2015 Feb 5;518(7537):27-9. doi: 10.1038/518027a.
3. https://www.rapidnovor.com/life-science-reproducability/
