摘要
干扰素-γ（IFN-γ）是一种关键的效应细胞因子，具有抗增殖、促凋亡和抗肿瘤的特性。它由活化的T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和自然杀伤T细胞（NKT细胞）在肿瘤环境中产生，标志着免疫系统的活跃程度。因此成像和检测IFN-γ生物标志物是监测抗肿瘤治疗效果及免疫信号传导效应的有效手段。本文研究团队之前开发了一种基于单克隆抗体（mAb）的放射性示踪剂，用于通过免疫正电子发射断层扫描（immunoPET）对IFN-γ进行成像和检测。然而，全长mAb的大小可能会限制其肿瘤穿透能力，从而无法准确描绘免疫反应，限制其应用效果。
因此，本文中研究者设计、生产并表征了四种基于双链抗体（Db）的放射性示踪剂。它们体积较小，可以迅速积累在肿瘤内，实现对IFN-γ的靶向免疫PET成像（图1）。首先，研究者利用快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗体蛋白从头测序服务获取了单抗的完整序列。接下来利用测得的序列，研究者通过在VH-VL之间加入不同长度的肽段连接子（7-13个氨基酸）构建了不同的Db序列，并进行锆-89放射性同位素标记。通过体内外表征评价了它们的物理化学特性、组织分布和免疫反应特性。
快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗体蛋白从头测序技术可以为Db和其他形式的抗体药物的构建和改造提供准确序列信息，确保最终抗体改造的准确性和有效性。
图1抗体蛋白从头测序助力双链抗体IFN-γ放射性示踪剂的开发
结果
双链抗体及其放射性免疫偶联物的表征
研究者首先通过重组表达生产了4种目的双链抗体，并通过SDS-PAGE对纯度进行测定（图2 A），采用MALDI-TOF检测分子量，代表性HL-11的质谱结果见图2 B。接下来通过异硫氰酸酯连接子将每个Db与去铁胺（DFO）偶联，代表性的HL-11和DFO偶联物的电喷雾电离高分辨质谱（ESI-HRMS）结果见图2 C。随后对它们进行锆-89放射性同位素标记和表征，其中HL-9因免疫反应性较差，在后续研究中被剔除。
图2 Db和Db-DFO偶联物的SDS-PAGE和质谱分析
小鼠PET成像检测同位素标记双链抗体
接下来研究者在CT26肿瘤小鼠模型中进行PET成像，观察了放射性同位素标记的HL-7，HL-11，HL-13在肿瘤组织的聚集和在体内的清除（图3 A）。其中HL-7和HL-11表现出了类似的肿瘤组织聚集能力，而HL-13最弱（图3 B）。
图3 PET成像检测Zr-89标记双链抗体在肿瘤组织的聚集
在成像结束后，对动物进行安乐死，通过γ计数器检测放射性免疫偶联物的组织分布情况，HL-13的组织摄取程度低于HL-7和HL-11（图4 A）。比较肿瘤/正常组织摄取药物的比例，发现在肝脏、肾脏、肌肉中所有药物的分布比率无显著差异。但是HL-11的肿瘤/血液分布比率显著低于HL-13，但与HL-7相当（图4 B）。
图4 PET成像后检测Zr-89标记双链抗体的组织分布情况
同位素标记双链抗体的生物分布和竞争结合研究
接下来研究者观察了注射后1、3、24 h三种放射性免疫偶联物示踪剂的组织微分布情况（图5 A-C）。在注射后3 h它们在CT26肿瘤的分布均达到峰值，优于先前报道的同位素标记单抗（72 h）。研究者在注射示踪剂同时或之前，注射了未标记的Db或全长单抗（AN-18），观察它们与示踪剂竞争结合IFN-γ的能力。结果表明，加入Db或AN-18以后，三种示踪剂在肿瘤组织的分布减少，表明其检测肿瘤内源性IFN-γ有较好的特异性（图5 D）。综合以上研究，研究者认为HL-11最适合开发成IFN-γ示踪剂，但有待进一步优化。
图5 免疫复合物注射后的体内微分布情况和识别肿瘤组织IFN-γ特异性
关键点
1. 本文研究者构建了同位素标记双链抗体示踪剂用于肿瘤组织IFN-γ的靶向免疫PET成像，其吸收分布速度优于先前报道的同位素标记mAb示踪剂。
2. 本文研究者使用快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗体蛋白从头测序技术获得了mAb的全长序列，并引入7-13个氨基酸长度肽链连接VH-VL区域构建Db。基于质谱的抗体蛋白从头测序技术可以精准获得氨基酸序列，为工具抗体的构建提供助力。
参考文献
Rezazadeh F, Ramos N, Saliganan AD, Barr S, Peraino N, Schomburg F, Rancour D, Viola NT. Evaluation and selection of a lead diabody for interferon-γ PET imaging. Nucl Med Biol. 2022 Nov-Dec;114-115:162-167. doi: 10.1016/j.nucmedbio.2022.06.001. Epub 2022 Jun 17. PMID: 35753939.
