摘要：
T细胞受体（TCR）工程化T细胞在实体瘤的治疗方面潜力巨大，研究应用前景广阔。目前αβTCR工程化T细胞已用于临床，但仅有少数患者能获益。造成应答率较低的一个重要原因是患者接受的治疗产品中仍含有非工程化及工程化不良的T细胞。除了优化工程化细胞，开发有效的工程化T细胞纯化和治疗后清除策略也将促进这些新型治疗方法更好地治疗患者。在本文中研究人员采用了一种策略，利用一种抗人αβTCR单克隆抗体，来实现工程化T细胞的纯化。首先团队发现这种人αβTCR的抗体能够与人αβT细胞TCR β链上的表位结合。进一步的表征表明，当将人TCR β链恒定区结构域3中的两个氨基酸残基鼠源化后，这种结合会丧失，从而实现工程化T细胞的纯化。此外由于T细胞疗法可能引起细胞因子释放综合征（CRS）、脱靶效应等副作用，研究者尝试寻找用于治疗后或必须情况下体内工程化T细胞的清除方法。他们找到了一种源自亚美尼亚仓鼠的抗小鼠TCR β链抗体，并进行了活性验证和后续的人源化和抗体偶联药物（ADC）改造。该方法可以用于加入额外7个氨基酸位点鼠源化后的工程化T细胞清除，初步验证了这种策略的理论可行性，但有待后续研究进一步完善。
了解抗体-抗原相互作用是工程化T细胞开发策略的关键。快序生物（Rapid novor）的REmAb从头蛋白测序技术为本研究提供了抗体序列的详细信息，为抗体和TCR的改造决策提供了重要信息。
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图1蛋白从头测序助力αβTCR和抗体改造
结果
抗体结合人αβT细胞的TCR β链的机制研究
为了实现非工程化和工程化不良的αβT细胞的定向清除，研究者找到了抗人αβTCR的抗体BW242/412进行研究。该抗体特异性识别人αβTCR，而不识别鼠αβTCR。通过人-鼠的TCR α链和β链配对、恒定区转换和氨基酸替换来研究该抗体识别人αβTCR的机制。发现人TCR β链恒定区结构域3的T110P和D112G两个位点鼠源化后，突变的αβTCR不被该抗体识别。这为工程化T细胞纯化提供了结构基础。
表达改造αβTCR的工程化T细胞的构建纯化和活性验证
由于外源引入的αβTCR可能与内源αβTCR形成错配，可能降低外源TCR的细胞表面表达和导致移植物抗宿主病(GvHD)。研究者结合了一系列策略，包括将最少关键氨基酸替换成鼠源、通过CD4/CD8磁性细胞分选（MACS）从PBMCs中预筛选T细胞、在TCR αβ链引入半胱氨酸形成二硫键，和将跨膜区替换为人源γδTCR，实现了表达目的TCR的T细胞富集（图2 A B）。接下来研究者把抗原肽负载在T2细胞系上，刺激表达不同TCR突变体的T细胞，发现T细胞目的外源TCR的阳性率越高，释放IFNγ的能力越强（图2 C）。在两株表达目的蛋白NY-ESO-1并递呈目的抗原肽的肿瘤细胞系Saos-2和U226上也得到类似的结果（图2 D），证明了通过上述流程纯化的T细胞，对肿瘤细胞的识别能力更强。
图3利用突变特异性抗体清除工程化T细胞
开发靶向引入突变区域的工程化T细胞特异性清除方法
由于工程化T细胞可能会导致细胞因子释放综合征、脱靶效应等毒副作用，因此研究者想要开发一种在紧急情况下使用的工程化T细胞体内清除方案。首先研究者试图免疫大鼠筛选特异结合T110P+D112G的TCR β链最少鼠源化肽段的抗体，实现两个位点突变同时完成工程化T细胞的纯化和清除，然而没有成功。
人和小鼠的TCR β链恒定区结构域3共有11个氨基酸位点差异。研究者发现在先前引入的2个最少鼠源化位点（2/11）的基础上，再引入7个鼠源化位点（9/11）的突变体可以被抗鼠TCR β链抗体（MuTCRβ）所识别（图3 A B C）。由于MuTCRβ抗体来自亚美尼亚仓鼠，注入人体可能导致严重副作用，研究者将其恒定区转化为人IgG1恒定区构建人源化嵌合体，其对工程化T细胞的识别结合活性得到保留（图3 D）。进一步，研究者把该嵌合抗体与一甲基澳瑞他汀E（MMAE）连接构建ADC。在缺失内源αβTCR的Jurkat-76淋巴瘤细胞中表达上述9/11鼠源化目的αβTCR后，合成的ADC药物可以杀伤该细胞（图3 D E）。本文初步展示了通过抗体药物清除表达目的αβTCR的T细胞的理论可行性，但是还有待后续研究进一步的探索和完善。
图3利用突变特异性抗体清除工程化T细胞
关键点
1. 本文发现将人TCR β链的2个位点氨基酸残基鼠源化，通过已有的特异性抗体可实现工程化T细胞的富集。
2. 文中研究者初步探究了通过抗体改造ADC药物实现工程化T细胞清除的理论可行性，未来对TCR进一步设计改造和筛选特异性抗体将助力该目标的实现。
3. 研究者使用了快序生物（Rapid novor）的REmAb抗体从头测序平台获得了抗体序列，并对其进行人源化改造用于研究。通过质谱对抗体进行从头测序，可以获得准确的序列信息，为TCR和抗体的定向改造提供指导，助力工程化T细胞疗法的开发。
参考文献
Kierkels GJJ, van Diest E, Hernández-López P, Scheper W, de Bruin ACM, Frijlink E, Aarts-Riemens T, van Dooremalen SFJ, Beringer DX, Oostvogels R, Kramer L, Straetemans T, Uckert W, Sebestyén Z, Kuball J. Characterization and modulation of anti-αβTCR antibodies and their respective binding sites at the βTCR chain to enrich engineered T cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 Jun 24;22:388-400. doi: 10.1016/j.omtm.2021.06.011.
