重链抗体（HCAbs）是一类独特的抗体，不含轻链，仅由两条重链组成。它通过重链抗体可变区（VHH）识别抗原，VHH也称单域抗体（sdAb）或纳米抗体（Nb）。在骆驼科动物的血清中，重链抗体甚至能占到总IgG含量的81%，表明其在免疫系统中有着重要地位。本文综述了自纳米抗体发现的30年里，科研界和产业界对纳米抗体的深入研究，和纳米抗体应用的拓展、商业化与未来。
1. 骆驼科动物重链抗体的产生
自然选择：骆驼科动物可能是为了应对病毒威胁，发展出了这样独特的免疫系统。这种同源二聚体的重链抗体，对许多传统抗体难以应对的病毒能够发挥良好中和作用。此外，骆驼科动物所处的极端环境也使得它们的抗体对高温有更强的耐受性，一些源自骆驼的VHH甚至能耐受高达90°C的温度。
适应性互补抗原识别策略：与其他哺乳动物类似，骆驼科动物通过IGHVH(VHH)-IGHD-IGHJ基因重排来产生抗体多样性，对现存骆驼科动物免疫球蛋白重链可变区（IGHVH）基因分析表明，它们来自共同的祖先。重链抗体通过突变和遗传漂变发生了进化，使得它们能以更简单的形式组装，发挥抗原结合效力。具体而言，VHH的框架区（FR）2中，一个保守疏水性氨基酸发生亲水性突变，从而导致轻链可变区（VL）缺失；CH1与铰链外显子之间内含子5′端的一个保守点突变（G＞A）使得重链恒定区（CH1）缺失，这种改变会利于其分泌（图1 A）。VHH呈现出更多样的环构象和更长的CDR1和CDR3区域，弥补了VL的缺失。例如双峰驼和羊驼的CDR3平均有17-18个氨基酸，这种变化可增强它们的抗原亲和力，也包括对隐蔽表位的亲和力（图 1B）。VHH中通过非经典的半胱氨酸形成额外的二硫键，能够稳定CDR3环并增加抗原亲和力（图 1C）。重链抗体的铰链区灵活多变，可以通过减少空间位阻增强与抗原结合（图 1D）。IGHVH中突变热点增多，使得体细胞超突变频率增加，进一步增强抗原识别能力，维持抗体多样性。
鲨鱼与骆驼重链抗体有趋同的进化模式
鲨鱼是拥有适应性免疫系统的最古老的脊椎动物，它们进化出了独特的免疫球蛋白新抗原受体（IgNAR），也由单个可变区（VNAR）负责抗原结合。鲨鱼的VNAR在保守区域的溶剂暴露区域含有极性和带电氨基酸，提高了抗体溶解度，骆驼科动物重链抗体的VHH似乎模仿了这一特性。这种不同物种中抗体表现出相似性状的趋同进化模式，表明这些特征在它们所处的栖息环境中具有进化优势。此外，这两个物种的纳米抗体都可以通过母婴传递，有助于新生儿的免疫发育。
图 1 重链抗体与纳米抗体结构的适应性进化
2. 纳米抗体的研究与商业化
纳米抗体由于体积小、稳定性强且抗原亲和力高等优点，自被发现以来的三十年间已引发了巨大的商业兴趣，全球专利申请数量迅速攀升。2014年，全球纳米抗体专利申请数量首次超过1000件，此后年增长率达20%（图 2A），2020年，授权专利数量超过1000件。目前，大多数纳米抗体专利申请集中在美国（>1000件/年），其次为欧洲和中国（图 2B）。例如美国的Regeneron有超过1000件专利申请、400多项授权专利；欧洲的Novartis和Ablynx各自拥有超过250项授权专利（图 2C）。
图2 全球纳米抗体的专利分布
基于纳米抗体文库的筛选路径已被广泛应用于纳米抗体的开发中（图3 A）。此外，合成文库和天然纳米抗体开发也受到关注，基于深度测序或质谱鉴定的筛选方法也被用于纳米抗体研究。纳米抗体已在许多生物医学领域被广泛应用：例如用于癌症、神经疾病等领域的治疗；传染病、生物毒素的诊断或中和；医学成像与快速检测等（图3 B）。一些基于纳米抗体的产品已进入临床或获批上市：例如包括人源化纳米抗体、基于纳米抗体的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法、双特异性纳米抗体形式的产品已先后在美国、欧洲、日本、中国被批准上市（图3 C）。
图3 纳米抗体的筛选和应用
3. 纳米抗体研究的未来
纳米抗体应用领域的拓展及其商业化，带来了技术的接纳、升级与变革。提升纳米抗体的亲和力与稳定性，将改善其应用性能。一种方法是构建比单价抗体效力更高的多价纳米抗体。例如针对新冠病毒的二价三价纳米抗体已被应用，四价、五价、甚至十价纳米抗体也被成功制备。通过将纳米抗体整合到高度稳定的蛋白质框架（如铁蛋白）中可以增强其稳定性。计算方法和数据挖掘技术的进步，也推动了合成或天然VHH文库构建的发展，使研究人员能够基于现有序列和结构信息设计合成文库。当无法对动物进行免疫时，可以通过这些文库进行筛选。深度测序和质谱鉴定手段结合或替代噬菌体或酵母展示技术，将拓展纳米抗体的筛选方法。纳米抗体的给药方式也更加多样化。综上所述，纳米抗体相关技术的强劲增长趋势，让科学家们对其在未来革新医疗技术的潜力充满信心。
关注点：
（1） 纳米抗体由于体积小、稳定性好、亲和力佳等特性，受到研究人员的广泛关注，已成为了重要治疗和诊断、科研用抗体。
（2） 产学研的密切合作将加速纳米抗体研究创新，为更多复杂的应用场景提供解决方案，例如CAR-T、双抗、多价纳米抗体、纳米抗体探针等形式的产品。
（3） 重链抗体在骆驼科动物血清IgG中占比可高达81%，通过Rapid Novor（快序生物）全球唯一的血清多抗测序技术可以高效获得优质纳米抗体序列，拓展纳米抗体筛选路径。
参考文献：
[1] Yu T, et al. Single domain antibody: Development and application in biotechnology and biopharma. Immunol Rev. 2024 Nov;328(1):98-112. doi: 10.1111/imr.13381.
