发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）是一种新出现的蜱传病毒，会引起严重的病毒性出血热，死亡率高达12%-50%，然而目前缺乏有效的疫苗和干预措施。现有的研究表明，SFTSV的N端糖蛋白（Gn）在识别宿主细胞受体过程中发挥关键作用。本研究分析了4名SFTSV感染康复者的Gn反应性记忆B细胞，采用单B细胞筛选技术，获得出了18个对SFTSV有较好中和活性的抗体，并对其中高活性的三株抗体（JK-2, JK-8和JK-12）进行了结构和作用机制解析。在SFTSV毒株致死性感染小鼠模型中，JK-2和JK-8对5种SFTSV主要流行毒株的感染均有显著的保护和治疗效果[1]。
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结果
从SFTSV感染康复捐献者血液中发现结合Gn的单抗
首先，研究团队筛选出了4名捐献者，他们感染的是在中国主要流行的SFTSV基因型，且住院期间发生过持续性病毒血症，未使用抗病毒药物，经检测血液内有高滴度中和抗体。对他们的外周血单个核细胞（PBMC）进行分析表明，一群B细胞（6.6%–17.2%）发生了IgG类别转换（CD19+IgM-IgD-IgG+），其中一小部分（0.5%–1.9%）能识别结合Gn（图1 A）。感染恢复后2个月采集的血液样本中这些细胞的占比，高于1和6个月采集的样本（图1 B）。这些细胞中80%表达CD27，表明它们为记忆B细胞（图1 C）。对这些细胞进行单B细胞基因克隆，共获得并表达验证了283个单抗，其中146种（51.6%）对Gn有结合活性（图1 D）。与康复后1个月采血样的1号捐献者相比，2-4号捐献者采样间隔时间更长（2-6个月），他们筛选到的抗体体细胞超突变（SHM）频率更高（图1 E）。对配对的重链和轻链序列进行分析，发现4名捐献者Gn反应性的B细胞存在克隆多样性（图1 F）。VDJ基因分析显示，重链IGHV5-51/IGHV4-39/IGHV3-15/IGHV3-30和轻链IGKV1-5/IGLV1-40的使用和重排频率较高（图1 G H）。
图1 Gn的抗体的克隆多样性
鉴定SFTSV的广谱中和抗体
接下来，研究团队分析了146种抗体对SFTSV I型病毒的中和作用，筛选出了18种抗体，它们在250 ng/mL浓度下表现出超60%的抑制效果（图 2A）。这些抗体对5种SFTSV分支均表现出不同程度中和能力，其中JK-2、JK-8、JK-12、JK-77和JK-79对所有检测的病毒均展现出强效、广泛的保护作用（图2 B C）。此外，这5种强效抗体均呈剂量依赖性抑制SFTSV在Vero细胞中的感染（图2 D）。
图2 筛选到的抗体对SFTSV有广谱中和活性
SFTSV抗体的抗原特异性及亲和力测定
为了分析病毒表面与这18个抗体结合的主要表位，研究团队利用生物膜干涉技术（BLI）开展了竞争结合分析，结果表明它们根据结合表位可分为6组（图3 A）。其中JK-8亲和力最高，平衡解离常数（KD）为1.0 pmol，其次为JK-2，KD为21.2 pmol（图3 B）。
图 3 Gn抗体的抗原特异性及亲和力
抗体对SFTSV的中和机制研究
通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测病毒粒子水平（图4 A），发现使用JK-77、JK-2、JK-8 或 JK-3预孵育病毒可以有效抑制SFTSV感染THP-1细胞。流式细胞术结果表明，JK-2、JK-8以及JK-77能够呈剂量依赖地抑制SFTSV与细胞结合（图 4B）。当病毒以50 μg/mL的浓度分别与JK-2或JK-8预孵育时，SFTSV与细胞的结合分别显著降低了约91%和88%（图 4 C）。当把SFTSV与JK-2和JK-8孵育后，其感染细胞能力丧失，而JK-12或JK-65抗体没有这种显著的阻断效果（图4 D E）。
图4 G JK-2和JK-8抑制SFTSV感染细胞
Gn与中和抗体复合物的结构分析
为了更深入了解不同抗体具有独特中和活性的分子机制，研究团队选取了3种抗体（JK-2、JK-8和JK-12）与Gn头部结构域形成复合物，进行冷冻电镜结构分析。对抗体结合位点的整体比较结果表明（图 5A），JK-2和JK-8结合到Gn的结构域I；JK-12结合到Gn的结构域III。JK-8与Gn之间的结合主要源于氢键和静电力；JK-12与Gn之间的结合主要源于氢键、盐桥、疏水作用。在模拟病毒粒子表面的SFTSV六聚体和五聚体中，JK-8能中高效结合Gn蛋白，不受相邻区域的阻碍，而Gn的空间位阻影响JK-12结合（图 5B）。这可能是JK-8和JK-2具有高亲和力和良好中和效果，而JK-12虽有高亲和力但缺乏阻断活性的重要原因。
图5 JK-2/JK-8/JK-12结合Gn的结构解析
SFTSV抗体在致死性感染小鼠模型中的预防或治疗效果
接下来，团队构建了免疫缺陷的C57BL/6小鼠SFTSV致死性攻毒模型，评估了抗体对SFTSV导致小鼠死亡和体重降低的预防作用（图7 A B）。JK-2和JK–8可以发挥完全的保护作用，在攻毒后3-5天可将血清病毒载量降低至检测不到的水平（图 7C）。进一步，研究团队评估了JK-2和JK-8的治疗效果。在攻毒后第1或2天给药时，JK-2和JK-8都能对致死性SFTSV感染提供完全保护，这体现在存活率提高（图 7D）、体重维持（图 7E），以及对病毒血症和病毒向脾脏、肺、肝、肾等组织扩散的抑制（图 7F–H）。此外，给予JK-2或JK-8治疗后，脾脏白髓萎缩等异常组织病理学变化均显著减轻（图 7I）。
图6 SFTSV抗体在致死性感染小鼠模型中的保护作用
关注点：
1、本文中对SFTSV感染康复者的Gn反应性记忆B细胞进行单B细胞基因克隆，筛选得到了广谱强效中和抗体，并解析了其与抗原的结合作用机制，这将推进SFTSV预防治疗疫苗或药物的研究。
2、文中选择了四名高血清中和抗体滴度的捐献者样本进行测序。然而，抗体组库包括BCR库和分泌型抗体库，仅对外周血中BCR测序无法反应分泌型抗体库的真实组成和丰度，可能遗漏珍贵抗体。
3、Rapid Novor（快序生物）的REpAb是全球唯一的基于血清多抗直接测序的抗体发现技术，可以直接对抗原富集后，经性能评估验证的多抗蛋白进行测序，获得轻重链正确配对，经亲和力验证的抗体序列，复现原始多抗的优异性能[2]。
参考文献：
[1] Zhang S, Shang H, Han S, Li J, Peng X, Wu Y, Yang X, Leng Y, Wang F, Cui N, Xu L, Zhang H, Guo Y, Xu X, Zhang N, Liu W, Li H. Discovery and characterization of potent broadly neutralizing antibodies from human survivors of severe fever with thrombocytopenia syndrome. EBioMedicine. 2024 Dec 6;111:105481. doi: 10.1016/j.ebiom.2024.105481.
[2] Le Bihan T, Nunez de Villavicencio Diaz T, Reitzel C, Lange V, Park M, Beadle E, Wu L, Jovic M, Dubois RM, Couzens AL, Duan J, Han X, Liu Q, Ma B. De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination. Nat Commun. 2024 Oct 10;15(1):8790. doi: 10.1038/s41467-024-53105-8.
