口蹄疫病毒（FMDV）是一种高致病性病毒，会感染猪、牛、羊及其他偶蹄动物。全球已发现7种免疫学上不同的FMDV血清型（O、A、Asia1、C、SAT1~3），其中O、A和Asia1传播最广泛。目前，从大型动物中发现针对FMDV的广谱中和抗体（bnAbs）仍难以实现。本研究中使用单B细胞测序技术从接受抗原序贯免疫的猪的外周血单个核细胞（PBMCs）中获得了FMDV O型和A型反应性BCR库。从两个库共享的克隆型中找到了针对多种流行FMDV的bnAbs，并揭示了其B细胞起源及体细胞超突变（SHM），解析了抗体通过阻断病毒识别受体或破坏病毒粒子的稳定性发挥中和作用的机制。这种针对高变异毒株的通用中和机制可助力相关疫苗和诊断治疗方法的开发。
主要结果
FMDV特异性猪B细胞库的构建与表征
为诱导产生FMDV的广谱中和抗体，研究团队用O型和A型毒株的灭活完整病毒粒子（146S）抗原对猪进行免疫（图1 A）。血清中和试验结果表明，在162天后，成功产生了对不同FMDV的中和抗体（图1 B）。接下来，研究团队开发了一种结合磁珠分选以及荧光激活细胞分选（FACS）和单细胞测序的方案（图 1C），构建了源自浆母细胞和记忆B细胞的针对FMDV O型和A型血清型的猪BCR库（图1 D E）。在两个库中发现了216个共有克隆型，表明不同FMDV存在保守的抗原结构（图 1F）。在O和A型库中频率最高的克隆型中，有四个是共有克隆型（图 1G）。浆母细胞表现出高于记忆B细胞的SHM水平，表明在猪的抗体应答中，从记忆B细胞向浆母细胞的发育过程中可能发生抗体亲和力成熟（图 1H）。
图1 FMDV反应性猪BCR库的制备及分子特征分析
FMDV O型和A型BCR库中共享克隆型对Asia1具有中和活性
接下来，研究团队从216个共有克隆型中挑选了SHM及文库中出现频率排名前10的克隆进行中和活性评估（图1 F）。结果表明，大多数抗体（15/20）对至少一种毒株表现出中和活性。其中10种抗体对O型和A型的6种流行毒株均表现出广谱中和活性。并且，对未接种抗原的Asia1型也有7种抗体表现出强效的中和活性（图2）。而意外的是，虽然本研究使用A/AF72抗原免疫动物，但所获得的bnAbs均无法中和A/AF72株，表明古老的A/AF72与现流行的毒株在抗原结构上可能存在较大差异。
图2 共同克隆型抗体对FMDV的广谱中和作用
FMDV的bnAbs结构和作用机制解析
采用抗体识别FMDV 146S变性抗原的WB结果表明，大多数bnAbs（9/10）识别的是线性表位（图3 A B）。对一系列GST-VP1（衣壳蛋白）截短蛋白的WB结果表明，这9个抗体与G-H环内的所有截短蛋白结合。而不与C末端结合（图3 B），它们识别的最小单位是145RGDL148（图3 C D）。将位点依次替换为丙氨酸的WB结果显示，146和147单个位点的替换完全消除了抗体的作用（图3 E）。对所有毒株序列对比表明，RGDL序列是严格保守的，是FMDV抗体发挥广谱中和作用的关键位点（图3 F G）。FMDV利用整合素（通常为 αvβ6）作为主要受体进入上皮细胞，引发宿主感染。对FMDV-αvβ6的结合构象分析表明，这些相互作用残基大多与FMDV广谱中和作用的抗原表位重叠（图3 H）。基于活性病毒粒子和毒株完整结构蛋白的位点突变研究表明，VP1的RGDL和VP2 68(D)（pOA-2）是两个广谱抗体作用的抗原表位（图3 I J）。通过冷冻电镜发现，每个FMDV病毒粒子表面可结合60个拷贝的pOA-2单链可变片段（scFv），并解析了pOA–2 scFv与FMDV-O18和FMDV–AWH形成复合物的结构和关键决定簇。
图3 bnAbs结合表位、关键决定簇的鉴定及其与整合素受体（αvβ6）识别位点的重叠情况
SHM平衡中和抗体的广谱性与效力
对获得抗体序列的进化树分析表明，大量SHM的累积使得B细胞获得了广泛的中和能力。对包含广谱中和抗体pOA-2的克隆谱系进化树分析表明，所有抗体均能与FMDV的O型和A型毒株结合，且均发生了不同程度的SHM积累（图 8 A-D）。对pOA-2、162和165的交叉中和效力进行比较，发现进化程度更高的162和165对A/GDMM/2013毒株的中和效力显著增强，但部分丧失了广谱中和效力（图8 E）。这些结果表明，在猪对FMDV的免疫反应中，SHM对平衡抗体的中和作用效力和广度方面发挥关键作用，过多的SHM可能使抗体偏离广谱抗体的轨迹，形成更专一强效的抗体（图4 E）。
图4 SHM对含pOA-2克隆谱系抗体广泛中和作用的重要性
bnAbs通过阻断病毒附着细胞和破坏病毒粒子稳定性实现FMDV广谱中和作用
对三株代表性的bnAbs（pOA-1、pOA-2和pOA-13）与FMDV O型（O/Tibet/99）和A型（A/WH/CHA/09）的结合动力学研究表明，pOA-2和pOA-13对O型和A型146S抗原均表现出了nM级亲和力；pOA–1对O型的亲和力远高于A型（0.04 vs 2.48 nM），对前者是缓慢结合解离，对后者是快速结合和解离（图5 A B）。阻断病毒附着细胞是中和抗体的主要策略，pOA-1、pOA-2和pOA–13预孵育能减少病毒在BHK-21细胞上的附着，体现在病毒结构蛋白（图5 C D）、RNA（图5 E F）、蚀斑形成的减少（图5 G H）。此外，pOA-2的结合明显降低了FMDV粒子的稳定性（图 5 I）。综上所述，pOA-2通过阻断病毒附着到细胞和破坏病毒粒子稳定性的双重机制，实现对FMDV的广谱中和作用。
图5 bnAbs对FMDV的广谱中和作用机制
关注点
（1）本文通过单B细胞测序的方法对FMDV O型和A型抗原序贯免疫的猪PBMC进行分析，从O型和A型反应性BCR库中获得了bnAbs，并解析了其进化、结构、中和作用机制，有助于FMDV广谱性疫苗和疗法的开发。
（2）文中从包含几千个序列的FMDV O型和A型BCR库中选择了216个共有克隆型，根据SHM和抗体出现频率筛选出了20个抗体进行验证。虽获得了部分FMDV的广谱中和抗体，但这种策略也体现出想要对BCR库进行全面评估并不容易。
（3）文中采用了A/AF72作为抗原免疫动物，且血清中和试验表明对该抗原有较好中和作用，但最后筛选出来的抗体全部对A/AF72无中和作用，表明外周血B细胞与循环抗体的匹配程度有限，仅对B细胞测序可能遗漏珍贵抗体。
（4） Rapid Novor（快序生物）可以提供全球唯一基于血清多抗直接测序的抗体发现路径，可以直接对抗原富集后，经性能评估验证的多抗蛋白进行测序，获得轻重链正确配对，经亲和力验证的抗体序列，复现原始多抗的优异性能。
参考文献
[1] Li F, et al. Discovery, recognized antigenic structures, and evolution of cross-serotype broadly neutralizing antibodies from porcine B-cell repertoires against foot-and-mouth disease virus. PLoS Pathog. 2024 Oct 15;20(10):e1012623. doi: 10.1371/journal.ppat.1012623.
