免疫肽组（immunopeptidomics）是由MHC I类或者MHC II类分子呈递到细胞表面的所有多肽组成的，这些多肽可以被T细胞识别。免疫肽组将多肽组和免疫联系起来，通过鉴定免疫肽组，一方面可以发现个性化的肿瘤治疗靶点，即肿瘤新抗原靶点（MHC分子呈递到细胞表面的突变肽），来对单个患者进行精准的靶向治疗；另一方面也能找到患者间共享的抗原，让更多的肿瘤患者受益。本文就是通过鉴定群体的免疫肽组找到了一个高表达的共享位点COL6A3-FLNV，针对此位点改造的TCR具有治疗肿瘤的疗效。
摘要
为了治愈更多的患者，需要找到患者间共享的肿瘤抗原，团队选用了群体规模的免疫肽组鉴定，使用质谱定量分析了约1500个肿瘤和正常组织样品。他们发现了一个HLA-A*02:01呈递的泛癌抗原——胶原VI型α-3（COL6A3），该抗原在多种实体癌中特异性高表达，在正常组织中几乎不表达，是一个理想的肿瘤治疗靶点。然而，研究发现，天然的特异性T细胞仅对COL6A3/HLA-A*02:01高表达的肿瘤细胞有反应活性。为了增强T细胞的抗肿瘤反应，让其对COL6A3低表达的肿瘤细胞也有反应，团队利用酵母展示技术筛选到两个特异性TCR的突变体a1b4和awb4，改造后的TCR变体能够有效杀伤小鼠体内的肿瘤，显示出良好的安全性，无明显脱靶效应，为TCR靶向多种实体瘤的临床试验铺平了道路。
结果
1. 群体规模定量免疫肽组发现了泛癌抗原COL6A3-FLNV
利用液相色谱-质谱（LC-MS）对HLA I结合的多肽进行鉴定和定量。团队选择使用HLA-A*02特异性抗体（在美国白人种群中HLA-A*02亚型占比超过40%）进行免疫沉淀（IP）后，鉴定了739个肿瘤组织和673个正常组织的HLA-A*02呈递的多肽。该方法从肿瘤组织中发现了一个共享多肽COL6A3-FLNV，位于COL6A3的第6个外显子上，是由选择性剪接产生的变异多肽，序列为FLLDGSANV。数据显示，在28% （n = 210）的肿瘤中检测到COL6A3-FLNV，而正常组织样品只有1% （n = 7）能检测到（图1A）。值得注意的是，两个最明显的正常组织来自于胎盘，而癌症患者一般不会有胎盘组织。统计结果显示，肿瘤细胞表面呈递的COL6A3-FLNV比正常组织要高23倍。
为了更加准确的定量COL6A3-FLNV，团队使用平行反应监测（PRM）技术确定细胞表面COL6A3-FLNV的绝对拷贝数，合成了稳定同位素标记的多肽作为内标，通过高灵敏度靶向质谱来实现绝对定量。一共检测了233个肿瘤和正常组织样品，在134个肿瘤样品中有55个检测到了COL6A3-FLNV，平均每个细胞有228个拷贝（CpC），单个肿瘤样品最高有1928个CpC。在99个正常组织样品中，只在6个组织中检测到此多肽，平均含量为28 CpC，最高含量为49 CpC。多肽的绝对定量结果提示了TCR治疗的一个窗口期。
图1. 质谱检测到肿瘤（红色）和正常组织（蓝色）中的COL6A3-FLNV抗原
2. COL6A3-FLNV特异性TCR的发现和表征
T细胞识别肿瘤抗原的关键分子就是T细胞受体（TCR），团队使用COL6A3-FLNV/HLA-A*02复合物反复刺激HLA-A*02阳性和阴性献血者的T细胞，鉴定出91个独特的TCR序列。使用COL6A3-FLNV梯度稀释方法，找到了两种高灵敏度的TCR（D10和F9）以及低灵敏度的TCR（H3）进行进一步深入分析（图2A）。
为了表征每个TCR特异性识别COL6A3-FLNV的能力，团队构建了COL6A3-FLNV四聚体，发现F9和D10 TCR CD8 T细胞与COL6A3-FLNV特异性四聚体结合能力较强，H3 TCR CD8 T细胞的结合能力较弱。然而，进一步研究发现D10 TCR 会识别COL6A3-FLNV的类似肽COL6A1-ILSV（ILLDGSASV），这使得它不太适合用于过继性T细胞治疗。F9 TCR只有微弱识别，因此优先选择F9 TCR作后续研究。
图2.发现靶向COL6A3-FLNV抗原的特异性TCR
为了验证COL6A3-FLNV特异性TCR在体内是否具有抗肿瘤功能，团队构建了小鼠肿瘤模型。D10 TCR转导的T细胞抗肿瘤效果最好，但是有脱靶风险。H3 TCR转导的T细胞基本没有抗肿瘤效果。而F9 TCR转导的T细胞确实延缓了肿瘤的进展，但是与D10 TCR相比，表达F9 TCR的T细胞的抗肿瘤效果较弱（图3C），这表明需要进一步加强F9 TCR的活性。
图3. COL6A3-FLNV特异性TCR-T体内的抗肿瘤能力
3. 酵母表面展示方法筛选出亲和力更强的F9 TCR突变体
为了筛选到更高亲和力的TCRs，作者使用酵母表面展示的方法筛选F9 TCR的突变体，最终选择了a1b4和awb4这两个突变体，它们能够特异识别COL6A3-FLNV，并且无脱靶效应，具有很好的安全性（图4A）。
与亲本F9 TCR相比，a1b4和awb4突变TCR在COL6A3-FLNV浓度降低10至100倍的情况下依然能激活CD8 T细胞（图4C），表明TCR亲和力的增强使得T细胞能靶向拷贝数更低的抗原肽。高亲和力的TCR甚至能激活CD4 T细胞，COL6A3-FLNV可以在一定程度上以一种共受体不依赖的方式激活a1b4和awb4 TCR转导的CD4 T细胞（图4B）。
图4. 评估a1b4和awb4突变体T细胞的激活反应
4. a1b4和awb4 TCR-T细胞在体内的抗肿瘤效果
为了验证高亲和力突变体TCR-T细胞具有抗肿瘤的能力，团队构建了小鼠肿瘤模型。将肿瘤细胞植入皮下侧腹，并于第8天静脉注射表达a1b4和awb4 突变TCR的T细胞。结果观察到未突变的F9 TCR转导的T细胞控制肿瘤的能力很小，相比之下，两种突变体TCRs（a1b4和awb4）都能快速地、持久地杀伤肿瘤细胞（图5B-E）。而且表达a1b4 TCR的T细胞显示出比awb4更强大和更持久的抗肿瘤反应。总之，这些数据表明，表达awb4或a1b4 TCR的T细胞是有可能用于靶向并消除人类肿瘤的。
图5. a1b4和awb4 突变体TCR-T细胞在体内的抗肿瘤效果
关注点
本文使用的群体规模的免疫肽组鉴定，发现了多个患者以及多种肿瘤中共有的新抗原COL6A3-FLNV，针对该抗原开发的TCR-T过继性免疫治疗方法，有望实现治疗多种肿瘤类型或者延缓肿瘤的复发。
除此之外，对于免疫肽组鉴定还有一种个体化的治疗方案，就是检测单个患者的肿瘤组织和正常组织中的体细胞突变，找到单个个体所特有的肿瘤新抗原，实现高精度高特异性的精准治疗，能大大提升治愈肿瘤的希望。
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2）更真实，直接鉴定与MHC I结合的肽段，真实展现细胞表面被呈递的肿瘤抗原；
3）更多样，独有的肽段从头测序技术能够鉴定到多种不同来源的突变肽段；
4）更灵活，灵活选择弱酸洗脱或免疫沉淀法提取肽段，最大限度获取更多肽段。
参考文献：
Kim GB, Fritsche J, Bunk S, et al. Quantitative immunopeptidomics reveals a tumor stroma-specific target for T cell therapy. Sci Transl Med. 2022;14(660):eabo6135.
